LAPORAN PRAKTIKUM
BIOLOGI REPRODUKSI HEWAN
FERTILISASI IN VITRO
Oleh :
nama : Ervin Jumiatin
nim : 0910913018
kelompok : 1
LABORATORIUM FISIOLOGI HEWAN
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012
IN VITRO
FERTILIZATION
Ervin
J.,Animal Physiology Laboratory, Biology Department, Mathematics
and Science Faculty, Brawijaya University, Malang.
ABSTRACT
The aim of this practical was
to knowing of affected
goat serum supplementation on oocyte maturation medium by measuring expansion
of cumulus cell and nuclei transformation. The
methods of this practical was, preparation of goat oocyte, and then preparation
of in vitro fertilization medium, sperm preparation, oocyte preparation, semen
insemination, embryo development.
Key words : IVF, oocyte, TCM 199
BAB I
PENDAHULUAN
1.1
LatarBelakang
Suatu peristiwa pembelahan sel secara meiosis, dimana
pembelahan sel gamet dari dua sel atau bersifat diploid menjadi satu sel atau
haploid, dinamakan dengan pematangan oosit.fertilisasi in vitro (IVF) yaitu suatu
teknikdenganmenyatukanseltelurdariwanitadan
spermatozoa padacawan petri di laboratorium. Teknikinidilakukanbilakeadaanjumlahsperma
yang kurangdanadanyahambatanpada tuba falopii.Inseminasi buatan dan transfer
embrio merupakan bioteknologi yang mulaivbanyak diterapkan di Indonesia untuk
beberapa spesies tertentu. Penerapantransfer embrio membutuhkan embrio dalam
jumlah banyak yang dapat dipenuhivdari embrio hasil in vitro. In
Vitro Fertilisasi (IFV) meliputi
proses pematanganoosit, kapasitasi spermatozoa, fertilisasi dan perkembangan
embrio (Greveet al,1993).
Penyebab
utama hasil maturasi oosit yang tidak sempurna adalah ukuranpopulasi oosit yang
dimaturasi secara in vitro sangat heterogen sehingga prosesmaturasi
akhir tidak berjalan secara sempurna (Barenson dkk., 1988). Oosit yang dipanen
untuk produksi embrio in vitro dari folikel dominansebelum lonjakan LH
menghasilkan blastosis sekitar 50 %. Hal ini disebabkanoosit tidak memiliki
potensi atau kapasitasnya penuh untuk mendukungperkembangan embrio (Greveet
al, 1993). Oleh karena itu, maka perlu dilakukan praktikum infertilisasi in
vitro.
1.2
Permasalahan
Rumusan
masalah yaang dapat diambil berdasarkan latar belakang diatas adalah bagaimana
teknik ivf pada kambing.
1.3 Tujuan
Tujuan dari
praktikum ini adalah mempelajari pengaruh suplementasi serum kambing estrus
pada medium maturasi oosit kambing dengan mengukur ekspansi sel-sel kumulus dan
transformasi nukleus.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Ovarium adalah organ generatif hewan betina yang terdiri dari
sepasangterletak dikiri dan kanan uterus dalam rongga pelvis (Toelihere, 1985).
Tiapovarium terdiri dari dua bagian yaitu bagian tengah yang disebut medulla,
dansebuah lapisan yang tebal mengelilingi yang disebut kortex. Pematangan oosit
in vitro adalah pematangan oosit pada medium di luartubuh dan dikultur
secara in vitro. Adanya tehnik pematanganin vitro dimungkinkan
untuk memperoleh oosit matang dalam jumlah besardengan cara menanam telur yang
belum diovulasikan dalam medium pematangan(Bavister et al, 1992). Pematanganoosit
primer dapat berkembang menjadi oosit sekunder yang akan melakukanproses
pembelahan meiosis dengan normal dan sempurna sehigga menghasilkansel telur
yang siap untuk dibuahi.Oosit yang matang in vivo dan in vitro tidak
ada perbedaan yang nyata dalam tingkat pematangan inti, fertilisasi atau
pembelahan, tetapi bagaimanapuntergantung dari perkembangan kemampuan pada
oosit itu sendiri (Greve et al, 1993).
IVF adalahteknikmempertemukanseltelurdanspermadalamcawan
petri.IVF adalah proses
untukmenstimulasiovariumsupayamenghasilkansebanyakmungkintelur, mengambiltelur-telurtersebutuntukdapatdibuahiolehsperma di cawanpatri,
danmengembalikanhasilpembuahantersebutkedalamrahimdenganharapandapatmenempelsehinggaterjadilahkebuntingan.
IVF bukan merupakan langkah pertama untuk terapi
infertilitas. Sebaliknya, IVF digunakan pada kasus infertilitas yang tidak
dapat diatasi dengan terapi lain seperti obat fertilitas, pembedahan, dan
inseminasi buatan.IVF merupakan terapi yang efektif untuk infertilitas kecuali
pada infertilitas yang disebabkan oleh kelainan anatomi uterus seperti
perlengketan didalam uterus (rahim)yang berat(Bavister, 1992).
Indikasi IVF adalah pada infertilitas menurut Trounson (1992)disebabkan oleh:
- Faktor tuba
- Disfungsi ovulasi ( setelah gagal dengan terapi lain)
- Ovarian reserve yang sedikit: jumlah telur yang sedikit
- Endometriosis ( setelah gagal dengan terapi lain)
- Infertilitas dari faktor pria yang berat
- Ovarian failure
- Infertilitas yang tidak diketahui penyebabnya (setelah gagal dengan terapi lain)
Proses
meiosis
Tahapan dari pembelahan meiosis
yaitu diawali pada tahap profase, metafase I, anafase I, telofase I, dan
metafase II. Pada tahap ini merupakan tahap terjadinya ovulasi secara alamiah.
Salah satu kondisi yang sangat penting pada tahap pematangan oosit adalah
kondisi fisiologi dari pematang oosit sampai terjadinya proses ovulasi, dengan
hadirnya beberapa sinyal biokimiawi berupa hormon-hormon(Boediono
dkk.,, 1999). Hormon–hormon
tersebut antara lain FSH, LH, dan estradiol. Ketiga jenis hormon tersebut
bekerja sama dengan IGF- atau insuline like growth factor I, yang memiliki
fungsi merangsang granulosa untuk mensekresi hormon estrogen. Sedangkan fungsi
dan peran dari hormon gonadotropin dapat digantikan oleh hormon-hormon sejenis
lainnya seperti PMSG atau Pregnant mare serum gonadotropin serta HCG atau human
chorionic gonadotropin. Kedua jenis hormon ini, yaitu PMSG dan HCG memiliki
kemiripan bioaktifitas dengan FSH dan LH, sehingga dengan suplementasi PMSG dan
HCG pada medium kultur akan memengaruhi proses transformasi nukleus oosit (Gibbons
et al, 1994).
Sel-sel kumulus merupakan
bagian dari folikel, pada saat ovulasi sel ini selalu terbawa oleh oosit dan
menempel pada oosit(Cole dkk., 1997).
Fungsi sel kumulus adalah sebagai agen komunikasi antar sel dan penghubung
mekanisme hormonal menuju oosit, karena pada sel-sel kumulus terdapat banyak
reseptor FSH dan LH, yang juga berfungsi sebagai reseptor PMSG dan HCG. Sel
kumulus juga berperan sebagai pemasok nutrisi untuk oosit. Selain itu, sel
kumulus mengalami ekspansi atau mengembang jika terstimulasi oleh adanya
peningkatan aktifitas peran hormon gonadotropin dan metabolisme seluler(Gibbonset
al, 1994).
Sel kumulus mampu mensekresikan
progesteron, estradiol dan prostaglandin. Selain itu, sel kumulus juga berperan
penting dalam proses pematangan oosit dan melalui pengamatan tingkat
ekspansinya dapat dievaluasi tingkat kematangan oosit tersebut(Gordonet
al, 1994). Peran lain dari sel
kumulus yaitu pada saat proses fertilisasi. Lebih tepatnya pada saat kapasitasi
dan reaksi akrosom dari spermatozoa. Hal ini dikarenakan sel kumulus banyak
mengandung asam hyaluronat. Digunakan oosit kambing pada penelitian ini
mengingat produksi embrioin vitro baik di tingkat nasional maupun
internasional masih sangat rendahdibandingkan hewan ruminansia lain seperti
sapi. Dari beberapa hasil penelitianproduksi embrio blastosis pada sapi sekitar
30 – 40%, domba 36% dan kambing11% (Boediono, Suzuki, Li and Godke, 1999).
Pelaksanaan pematangan oosit
memerlukan kualitas oosit yang baik danpelaksanaan pembuahan diatur seperti
keadaan alami pada saluran reproduksiternak betina. Proses pematangan oosit in
vitro berguna untuk menyediakan oosityang berkembang baik pada sel
kumulusnya, pematangan komponen sitoplasmikdan pematangan inti pada tahap
metafase II, yang selanjutnya diperlukan untukproses fertilisasi (Trounson,
1992). Oosit yang berkualitas baik dalam jumlahyang cukup dibutuhkan dalam
pelaksanaan kegiatan pematangan oosit secara invitro. Kebutuhan oosit
ini dapat dipenuhi dari limbah ovarium hewan betina tanpamemperhatikan siklus
berahinya (Bavister, Rose, Hallakent and Piyopumminter,1992).
In Vitro Maturation adalah pematangan oosit pada medium di luar tubuhdan dikultur
secara in vitro (Gordon dkk., 1994). Adanya tehnik in vitro maturation
dimungkinkanuntuk memperoleh oosit matang dalam jumlah besar dengan cara
menanam teluryang belum diovulasikan dalam medium pematan.gan. Pematangan oosit
primer dapat berkembang menjadi oositsekunder yang akan melakukan proses
pembelahan meiosis dengan normal dansempurna sehigga menghasilkan sel telur
yang siap untuk dibuahi(Trounson, 1992)
Hormon-hormon reproduksi pada
wanita yang berperanan yaitu, pertama adalah estrogen. Estrogen
dihasilkan oleh ovarium. Ada banyak jenis dari estrogen tapi yang paling
penting untuk reproduksi adalah estradiol. Estrogen berguna untuk pembentukan
ciri-ciri perkembangan seksual pada wanita yaitu pembentukan payudara, lekuk
tubuh, rambut kemaluan,dll. Estrogen juga berguna pada siklus menstruasi dengan
membentuk ketebalan endometrium, menjaga kualitas dan kuantitas cairan cerviks
dan vagina sehingga sesuai untuk penetrasi sperma. Kedua yaitu, progesteron. Hormon
ini diproduksi oleh korpus luteum. Progesterone mempertahankan ketebalan
endometrium sehingga dapat menerima implantasi zygot. Kadar progesterone terus
dipertahankan selama trimester awal kehamilan sampai plasenta dapat membentuk
hormon HCG (Greveet al, 199).
Gonadotropin Releasing Hormone atau GnRH. GnRH merupakan hormon yang diproduksi oleh
hipotalamus diotak. GnRH akan merangsang pelepasan FSH (folikel stimulating
hormone) di hipofisis. Bila kadar estrogen tinggi, maka estrogen akan
memberikan umpanbalik ke hipotalamus sehingga kadar GnRH akan menjadi rendah,
begitupun sebaliknya.FSH (folikel
stimulating hormone) dan LH (luteinizing Hormone). Kedua hormon ini
dinamakan gonadotropoin hormon yang diproduksi oleh hipofisis akibat rangsangan
dari GNRH. FSH akan menyebabkan pematangan dari folikel. Dari folikel yang
matang akan dikeluarkan ovum. Kemudian folikel ini akan menjadi korpus luteum
dan dipertahankan untuk waktu tertentu oleh LH(Trounson, 1992).
BAB III
METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan
Praktikum ini dilaksanakan pada
pukul 08.00 WIB - selesai, Kamis 03 Mei 2012. Di laboratorium Fisiologi Hewan,
Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat
yang digunakan dalam praktikum ini antara lain laminar aie flow, sentrifuge,
incubator CO2, termos, water bath, culture dish 35 mm steril, spuit 5 cc, jarum
18 g, tisu, aluminium foil, hot plate, tabung reaksi steril. Bahan yang
digunakan yaitu ovarium kambing, TCM 199, serum, penicilin dan streptomisin,
parafin oil, NaCl 0.9 N, BO medium, PBS, BSA.
3.2 Cara kerja
3.2.1 Pematangan oosit
Preparasi
medium maturasi oosit dilakukan satu malam sebelum maturasi, yaitu dengan
membuat medium TCM 199 yang telah diantibiotik penicilin dan streptomisin.
Medium tersebut dibuat tetesan sebesar 100µl sebanyak 5 tetes pada culture dish
dan masing-masing 2,5 cc pada 2 culture dish yang lain, 50 cc pada erlenmeyer
sebagai medium pencuci oosit, medium-medium tersebut diinkubasikan kedalam
inkubator CO2 semalam. Selanjutnya ovarium kambing diambil dari rumah potong
kambing di pasar Sukun Malang, dengan dibawa dalam termos nasi ukuran kecil
yang diberi air dengan suhu 23-35o C didalam termos dimasukkan botol
berisi NaCl 0.9 N yang telah diberi penisilin streptomisin. Lalu botol ovarium
sesampainya di laboratorium diambil dari termos dan dimasukkan dalam water bath
dengan suhu 35oC. Disiapkan rak tabung reaksi dan 3 buah tabung
reaksi steril. Ovarium diambil dengan pinset dan dan dipegang dengan tisu,
ovariu yang lain tetap ditinggal dalam botol yang diletakkan dalam water bath.
Ovarium diaspirasi dengan menggunakan spuit dengan jarum suntik 18 g untuk
mengambil oosit. Oosit diambil dari folikel sekunder dan tersier saja, melalui
penyuntikan dibawah folikel, setelah jarum memasuki antrum folikuli, dilakukan
penyedotan cairan folikel, diharapkan oosit dan cairan folikelnya memasuki
spuit, lakukan ini pada semua ovarium yang diperoleh dari rph. Pada saat kerja
jarum tidak boleh menyentuh bagian lain selain tempat penyuntikan dan
penyedotan, hal ini untuk menghindari kontaminasi. Setelah spuit penuh dengan
cairan folikel, jarum dibuka dengan cara tutup jarum dengan penutup jarum, agar
jarum tidak menyentuh benda lain selain ovarium, setelah dibuka, masukkan
cairan folikel kedalam tabung reaksi dan dibiarkan sampai 10 menit, yaitu
sampai terjadi endapan, endapan tersebut merupakan endapan oosit dan beberapa
sel yang tersedot pada saat aspirasi. Supernatan dibuang dan dimasukkan lagi
medium pencuci oosit, dibiarkan beberapa saat sampai terjadi endapan lagi.
Diletakkan yang sudah dicuci kedalam cawan petri kaca dan diletakkan dibawah
mikroskop, diamati dan diseleksi oosit dengan melakukan pemipetan denga pipet
pastur yang di modifikasi ujung sesuai dengan ukuran oosit. Oosit diseleksi dan
diklasifikasi berdasar susunan sel-sel cumulus yang menempel pada oosit yaitu,
klas A adalah oosit yang ditutup penuh dengan sel-sel kumulus, kelas B adlah
oosit yang sebagian besr tertutup oleh sel-sel kumulus, kelas C adalah oosit
yang sedikit tertutup dengan sel-sel kumulus, dan kelas D adalah oosit gundul.
Lalu dipindahkan oosit kelas A dan B kedalam kultur dish yang mengandung 2,5 mm
medium maturasi oosit, diulangi sekali lagi pada culture dish yang lain,
sehingga oosit sudah tidak mengandung cairan folikel lagi. Oosit terseleksi
dipindah ke tetesan kultur 100 µl masing-masing drop maksimum berisi 25 oosit
terpilih. Diinkubasi oosit dalam inkubator CO2 selama 24 jam. Sisa-sisa sel
kumulus seperti pada langkah sebelumnya dipindahkan, pada culture dish lain
yang berisi TCM 199 FCS 10% untuk digunakan sebagai medium perkembangan embrio
yaitu dengan menggunakan sistem kokultur.
3.3.2 Fertilisasi in vitro
3.3.2.1 preparasi medium fertilisasi
in vitro
Disiapkan medium fertilisasi in
vitro dengan TCM 199 dengan FCS 10% dengan membuat masing-masing 10 cc yang
dimasukkan dalam spuit yang diinkubasikan minimal 1 jam sebelum fertilisasi.
Disiapkan medium TCM 199 dengan FCS 10% dalam bentuk, 2 buah culture dish
dengan volume 2,5 ml, 2 culture dish dengan tetesan-tetesan 25 µl dan culture
dish dengan tetesan 50 µl masing-masing ditutup dengan paraffin oil, dan
diinkubasikan minimal 1 jam sebelum digunakan. Medium ini digunakan sebagai
medium fertilisasi in vitro.Tissue Culture Medium atauTCM-199 adalah suatumedia yang bagus untuk pematangan oosit
secara normal. Pemilihan TCM-199 inisebagai medium dasar untuk in vitro maturation,
karena di dalamnyamengandung biokimia seperti asam amino, vitamin, glukosa dan
garam anorganikyang berperan dalam perkembangan oosit selama in vitro maturation.
Diantara cairan biologis yang terbukti dapat menunjang pertumbuhandiluar tubuh
adalah serum.
Serum
merupakan suatucampuran yang komplek dari berbagai biomolekul yang kecil maupun
yang besardan memiliki bermacam-macam aktifitas pendorong dan
penghambatpertumbuhan yang berada dalam keseimbangan fisiologis. Fungsi utama
serumadalah untuk menyediakan faktor hormonal, mineral dan lemak (Smith, 1990).
3.3.2.2 Preparasi sperma
Ejakulat sperma segar dengan
pengencer yang disimpan dalam refrigerator diencerkan dengan menggunakan TCM
199. Dilihat viabilitas dan mortilitas. Dimasukkan dalam tabung sentrifugasi.
Dilakukan sentrifugasi 2X, 3200 rpm selama 5 menit. Tabung divortex dan diambil
supernatan, dipindahkan ketabung lain. Konsentrasi sperma dihitung dengan
diletakkan semen dalam inkubator CO2. Dilakukan perhitungan sperma.
Cairan semen yang sperma dengan konsentrasi fertilisasi disimpan untuk menunggu
preparasi oosit.
3.3.2.3 preparasi oosit
Kompleks sel kumulus-oosit yang
telah dikultur selama 24 jam diamati perkembangan sel-sel kumulusnya dan
diklasifikasikan menjadi,
·
Grade 2, yaitu kompleks sel kumulus-oosit yang berkembang
sempurna
·
Grade 1, yaitu kompleks sel kumulus yang berkembang
sebagian
·
Grade 0, yaitu kompleks sel kumulus yang tidak mengalami
perkembangan sama sekali.
Hanya kompleks sel kumulus-oosit grade 2 yang digunakan
untuk fertilisasi in vitro. Kompleks sel-kumulus oosit terseleksi dipindah secara bertahap
kemedium fertilisasi in vitro dengan 2,5 ml dua kali kemudian dipindahkan ke
medium fertilisasi in vitro 250 µl dan terakhir dimasukkan kedalam medium
fertilisasi in vitro 50 µl siap diinseminasikan.
3.3.2.4 inseminasi semen
50 µl
cairan semen dengan konsentrasi 1 juta sperma/ ml dimasukkan kedalam medium 50
µl yang telah berisi kompleks sel kumulus-oosit yang berkembang sempurna. Hasil
inseminasi diinkubasikan minimal 6 jam.
3.3.2.5 perkembangan embrio
Menyiapkan
3 buah culture dish yang berisi 2,5 ml TCM 199 dengan FCS 10% yang telah
diinkubasi selama minimal 1 jam sebelum digunakan. Kultur dish berfungsi untuk
medium pencuci oosit. Fungsi inkubasi minimal 1 jam adalah untuk mengkondisikan
dari embrio yang telah tumbuh agar tidak mati. Pencucian dilakukan 3X, supaya
diperoleh hasil yang optimal. Selanjutnya memasukkan oosit ke dalam medium
perkembangan embrio TCM 199 dengan FCS 10% dengan menggunakan sistem kokultur.
Diamati setiap 24 jam dan 48 jam dilakuan pertukaran medium. Pengamatan setiap
24 jam sekali dilakukan karena waktu tersebut meruapakan waktu yang paling
tepat untuk mengamati perkembangan embrio.
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Analisa Prosedur
3.1.1 Pematangan oosit
Ovarium
kambing yang diambil dari rumah potong hewan segera ditempatkan pada wadah
tremos yang telah berisi air dengan suhu 25-35oC. Dan didalam termos
dimasukkan botol berisi NaCl 0.9 N yang telah diberi penisilin streptomisin. Fungsi
dari penyimpanan ovarium dalam tremos dengan suhu 25-35oC adalah
untuk mengkondisikan dengan suhu didalam ovarium tubuh kambing. Sedangkan
fungsi larutan NaCl 0.9 N yang telah diberi penisilin streptomisin adalah untuk
menjaga kondisi fisiologis ovarium kambing agar oosit tidak mati serta
berfungsi sebagai antibiotik.. Selanjutnya tujuan perlakuan memasukkan botol
ovarium ke dalam water bath adalah supaya suhu ovarium didalam botol tersebut tetap
stabil dan sel oosit tidak mengalami kematian atau kerusakan(Trounson, 1992).
Penambahan glutaminpada medium kultur dalam penelitian
inibertujuan untuk meningkatkan angkakeberhasilan fertilisasi.
Penambahanglutamin ke dalam medium kultur dapatmenggantikan peran Bovine
SerumAlbumin yang mendukung proses perkembangan
embrio secara in vitro. Pencucian spermatozoa denganmetode sentrifugasi dan
penambahankaffein benzoat dalam medium BO adalahdengan tujuan untuk
meningkatkanmotilitas spermatozoa dalam menembussel-sel granulosa oosit untuk mencapai zona pelusida dan selanjutnya masuk
ke dalam sitoplasma oosit(Malole, 1990). Selama proses fusi iniberlangsung selubung inti akan berintegrasisampai
terjadinya proses pembelahanmitosis yang pertama (cleavage)membentuk 2 sel.
Kondisi fusi danpembelahan pertama ini akan berlangsungpada temperatur medium
yangdipertahankan pada 30-400C dan kadar CO25%.
Temperatur inkubator yang tidak stabilakan mempengaruhi hasil fertilisasi in
vitro(Mogas dkk., 1996).
Pada tahap ini, LAF digunakansebagairuanganuntukpengerjaansecaraeseptis. Prinsip pengaseptisansuaturuanganberdasarkanaliranudarakeluardengankontaminasiudaradapatdiminimalkan. Fungsi untuk
mensterilkan alat ±alat seperti gelas dan dalam batas ± batastertentu dapat
juga digunakan untuk mensterilkan bahan ± bahan seperti kapas, kertas,dan kain.
Pada umumnya suhu yang digunakan adalah 170 ± 180oC selama ± dua jam(Lindsay,
1982). Sentrifuse berfungsi untukmempercepat proses
pengendapandenganmemberikangayasentrifugasipadapartikel-partikelnya.Selanjutnya
menyiapkan rak tabung reaksi dan 3 buah tabung reaksi steril. Ovarium diambil
dengan pinset dan dan dipegang dengan tisu, ovarium yang lain tetap ditinggal
dalam botol yang diletakkan dalam water bath. Penggunaan spuit dengan jarum
suntik 18 g untuk mengambil oosit, bertujuan agar oosit dalam ovarium kambing
dapat terambil dengan maksimal. Pada saat kerja jarum tidak boleh menyentuh
bagian lain selain tempat penyuntikan dan penyedotan, hal ini untuk menghindari
kontaminasi. Setelah spuit penuh dengan cairan folikel, jarum dibuka dengan
cara tutup jarum dengan penutup jarum, agar jarum tidak menyentuh benda lain
selain ovarium, setelah dibuka, masukkan cairan folikel kedalam tabung reaksi
dan dibiarkan sampai 10 menit, yaitu sampai terjadi endapan, endapan tersebut
merupakan endapan berfungsi untuk mengamati dan menyeleksi oosit dengan
melakukan pemipetan dengan pipet pastur yang di modifikasi ujung sesuai dengan
ukuran oosit. Lalu dipindahkan oosit kelas A dan B kedalam kultur dish yang
mengandung 2,5 mm medium maturasi oosit. TCM 199 FCS 10%, fungsinya adalah sebagai
medium perkembangan embrio yaitu dengan menggunakan sistem kokultur(Hyttel dkk.,
1997).
3.1.2 Preparasi medium IVF
Medium
fertilisasi in vitro dengan TCM 199 dengan FCS 10% dengan membuat masing-masing
10 cc yang dimasukkan dalam spuit yang diinkubasikan minimal 1 jam sebelum
fertilisasi. Medium tersebut digunakan untuk perkembangan embrio, melalui
sistem kokultur. Disiapkan medium TCM 199 dengan FCS 10% dalam bentuk, 2 buah
culture dish dengan volume 2,5 ml, 2 culture dish dengan tetesan-tetesan 25 µl
dan culture dish dengan tetesan 50 µl masing-masing ditutup dengan paraffin
oil, dan diinkubasikan minimal 1 jam sebelum digunakan. Tujuan inkubasi adalah
untuk mengoptimalkan proses perkembangan embrio atau teknik IVF. Selanjutnya
medium tersebut siap digunakan sebagai medium fertilisasi in vitro(Lindsay, 1982).
3.1.3 Preparasi sperma
Larutan sperma dengan TCM 199
dilakukan sentrifugasi 2X, 3200 rpm selama 5 menit. Hal ini bertujuan untuk
menghomogenkan antara sel sperma dengan TCM 199 sehingga partikel yang
bermuatan lebih besar akan mengendap pada dasar tabung. Pengambilan supernatan
dilakukan karena sel sperma merupakan partikel atau protein yang bermuatan
lebih ringan dibanding TCM 199. Konsentrasi sperma dihitung dengan diletakkan
semen dalam inkubator CO2. Hal ini dilakukan untuk mengetahui jumlah
sel sperma yang masih hidup dan fungsi inkubator untuk menjamin kemampuan hidup
sperma atau agar tidak segera mati sperma yang diamati. Sehingga akan diperoleh
sel sperma hidup yang selnjutnya dapat digunakan untuk IVF.
3.3.2.3 preparasi oosit
Kompleks sel kumulus-oosit yang
telah dikultur selama 24 jam diamati perkembangan sel-sel kumulusnya dan
diklasifikasikan. Kultur tersebut bertujuan untuk menumbuhkan dan dari sel
kumulus untuk prose IVF selanjutnya. Hanya kompleks sel kumulus-oosit grade 2
yang digunakan untuk fertilisasi in vitro. Hal ini dilakukan karena pada sel
kumulus grade2, memiliki perkembangan yang sempurna. Dimana terdapat kompleks
perkembangan sel kumulus dan oosit dengan baik. Kompleks sel-kumulus oosit terseleksi dipindah secara bertahap
kemedium fertilisasi in vitro dengan 2,5 ml dua kali kemudian dipindahkan ke
medium fertilisasi in vitro 250 µl dan terakhir dimasukkan kedalam medium
fertilisasi in vitro 50 µl siap diinseminasikan. Hal ini dilakukan untuk
memaksimalkan proses keberhasilan IVF.
3.3.2.4 inseminasi semen
50 µl
cairan semen dengan konsentrasi 1 juta sperma/ ml dimasukkan kedalam medium 50
µl yang telah berisi kompleks sel kumulus-oosit yang berkembang sempurna. Konsentrasi
sperma merupakan salah satu faktor keberhasilan IVF, apabila konsentrasi yang
digunakan kurang dari standar yang ditetapkan. Maka dapat mempengaruhi
keberhasilan IVF. Hasil inseminasi diinkubasikan minimal 6 jam. Waktu 6 jam
cukup untuk membuat sperma dan kumulus-oosit untuk segera berproliferasi hingga
terbentuk embrio.
3.3.2.5 perkembangan embrio
Disiapkan
medium untuk pencuci oosit yang telah difertilisasi yaitu dengan menyiapkan 3
buah culture dish yang berisi 2,5 ml TCM 199 dengan FCS 10% yang telah
diinkubasi selama minimal 1 jam sebelum digunakan. Oosit yang telah
diinseminasi dipindahkan kemedium pencuci, pencucian dilakukan 3X. Oosit yang
telah dicuci dimasukkan kedalam medium yang telah disiapkan sehari sebelumnya
yaitu medium perkembangan embrio TCM 199 dengan FCS 10% dengan menggunakan
sistem kokultur. Diamati setiap 24 jam dan 48 jam dilakuan pertukaran medium
yaitu dengan cara,
·
Dibuang sekitar 1 ml medium perkembangan embrio dengan
mikropipet pembuangan dilakukan dibawah mikroskop dengan mengamati embrio,
embrio sudah melekat pada dasar culture dish, kalau tidak melekat maka ada
indikasi terjadi kontaminasi.
·
Stelah itu dimasukkan kedalam culture dish tersebut
dengan medium baru yang sama
·
Pergantian dilakukan setiap 48 jam.
3.2 Analisa Hasil
Kemampuandalam IVM
tergantungpadaseberapamatangfolikelsudahadasekarang.Ada
beberapatahapdalamfolliculogenesis, dimulaidenganfolikel primordial, yang
kemudianmenjadi primer, sekunder, tersierawal (antral),
akhirtersierdanakhirnyafolikelpraovulasi.Padasiklusovulasi,
seltelur yang tidakdibuahiharusdikeluarkandaridalamtubuhbersamaandenganpendukungimplantasibayi
di dindingrahim, yaituendometrium.
Proses peluruhandindingrahimdandibuangnyaseltelur yang tidakdibuahiini, disebutmenstruasi(Cole et
al, 1997).
Secara hormonal, proses inidiawalidengandiproduksinyahormon gonadotropin (gonadotropin
releasing hormone) yang akanmemerintahkanpituitariuntukmenghasilkanhormon
FSH (folikel stimulating hormone) dan LH (luteinizing hormone).
FSH dan LH iniakanmenginisiasi (merangsang) pembentukanfolikeltempatpematanganseltelur
di dalamovarium. Folikel yang berkembangakanmenghasilkanhormon estrogen. FSH,
LH, danhormon estrogen
akanberpengaruhterhadappematanganseltelurselamalebihkurangduamingguhinggatibawaktuovulasi.
Estrogen yang dihasilkanakanberpengaruhpadaperkembanganfolikel,
merangsangpembentukan endometrium, sertamerangsangdiproduksinya FSH dan LH
lebihbanyak(Trounson, 1992).
Hormon FSH dan LH yang
melimpah di hari ke-12 siklusmenstruasiakanmemengaruhimasameiosis II
hinggaterjadiovulasi. Ovulasiterjadi di hari ke-14
danpadawaktuiniseorangwanitadikatakanberadadalamkeadaansubur.Masasuburtersebutberlangsungselamalebihkurang
24 jam saja(Toelihere, 1992).
Folikel yang
telah ditinggalkan oleh sel telur disebut badan kuning atau corpus
luteum yang menghasilkan hormon estrogen serta progesteron. Kedua hormon
ini bekerja menghambat sintesis FSH dan LH sehingga jumlahnya menjadi lebih
sedikit. Selain itu, mengakibatkan penghambatan pematangan folikel lain di
ovarium. Estrogen dan progesteron bersama-sama mempersiapkan kehamilan dengan
mempertebal dinding endometrium hingga mencapai ketebalan 5 mm. Jika tidak
terjadi kehamilan atau fertilisasi, corpus luteum akan berdegenerasi sehingga
produksi estrogen dan progesteron menurun. Jika kedua hormon ini menurun, tidak
ada lagi yang mempertahankan keberadaan endometrium sehingga endometrium
mengalami degenerasi(Bavister dkk., 1992).
Faktor
yang mempengaruhi keberhasilan IVF antara lain pengaruhumur, beratbadan,
kadarprolaktin, endometriosis, sertakadar gonadotropin endogen daneksogen. Selain itu
terdapat faktor-faktor lain yang tak kalah penting, yaitu usia maternal,
”ovarian reserve”, sertaperformansreproduksiterakhir. Faktor lainnya
yaitu Riwayatobstetrikreproduksisebelumnya, studi
menunjukkan adanya hidrosalfing menurunkan keberhasilan IVF; angka kelahiran
hidup satu setengah kali lebih rendah dibandingkan dengan wanita tanpa
hidrosalfing(Trounson, 1992). Selanjutnya, pada penelitian
menunjukkan salfingektomi yang dilakukan pada wanita dengan hidrosalfing
sebelum dilakukan IVF memperbaiki angka kehamilan. Cairan hidrosalfing dapat
mengganggu keberhasilan kehamilan melalui efek negatif terhadap embrio yang
ditransfer dan keadaan endometrium untuk implantasi.Selain itu, efek adanya
mioma terhadap IVF tergantung pada letak mioma. Mioma submukosa menurunkan
kemungkinan kesuksesan IVF dan sebaliknya mioma subserosa tidak memberikan efek
terhadap kesuksesan IVF.Merokok dapat menurunkan kesuksesan IVF dan berkaitan
dengan banyak efek samping dalam kesehatan. Kami menyarankan perokok untuk
berhenti merokok.Adanya riwayat kelahiran hidup sebelumnya meningkatkan
kemungkinan keberhasilan IVF, namun riwayat keguguran satu atau lebih
menurunkan kemungkinan keberhasilan(Gordon, 1994).
Faktor
terpenting yang berkaitan dengan prosedur IVF adalah jumlah telur yang diambil
dan jumlah embrio berkualitas baik yang berhasil dilakukan di laboratorium, kematangan
dari oosit, sehinga proses fertilisasi akan berhasil apabila didukungoleh
kematangan inti pada tahap metafase II.Padawanitausiamudadanpadamerekadengan
ovarian reserve normal,
akanlebihmungkinmencapaikehamilandaripadawanitausialebihtuadanmerekadengan
ovarian reserve yang menurun(Malole, 1990).
Wanitadenganriwayatpersalinansebelumnyaakanlebihbesarpeluangkeberhasilankehamilandaripadawanita yang
sebelumnya belum pernah hamil. Factor yang memengaruhi keberhasilan IVF menurut
Greve (1993)antara lain,
1. Usia
2. Kualitas ovum dan sperma
3. Durasi infertilitas
4. Kesehatan
uterus
5. Keahlian
tim medis
Pembahasan
lebih lanjut mengenai Usia sebagai salah satu faktor yang mempengaruhi Pregnancy
Rate adalah sebagai berikut :
Data hubungan
usia dengan tingkat keberhasilan kehamilan.
Usia
|
Tingkat
keberhasilan
|
<>
|
37%
|
36 - 39
tahun
|
28%
|
> 40
tahun
|
13%
|
> 44 tahun
|
Jarang
terjadi
|
Beberapa
faktor yang mempengaruhi keberhasilan IVF, diantaranyaadalahsystem maturasi
oosit, system kapasitasi spermatozoa dam pertumbuhanembrio hasil IVF. In
Vitro Maturation (IVM) dapat dipakai untuk memperolehoosit yang mature
dalam jumlah besar dengan cara mengkultur oosit dalammedium IVM tertentu.
Medium merupakan faktor penting dalam proses IVMtertentu. Medium merupakan
faktor penting dalam proses IVM yaitu sebagaipenyedia kebutuhan nutrisi, hormon
maupun faktor bahan biokimia lainnya untukperkembangan kumulus oophorus (Mogas dkk.,
1996).
Keuntungan yang ditawarkanoleh IVF bisaluarbiasa. Pasanganinfertil
yang sedangberjuanguntukhamilatau yang
frustrasiolehfaktabahwamerekatidakmampuuntukmenyusunalamiuntukalasanapa pun
mungkinmengalamistres, kecemasanataudepresi. IVF
menawarkanmerekaruteuntukmencapaitujuanmereka(Barenson, 1988).
Kelemahan terbesar dari IVF adalah bahwa itu tidak dijamin. Peluang
keberhasilan sangat bervariasi tergantung pada berbagai faktor termasuk usia wanita.
Wanita yang berusia lebih dari usia 35 mungkin tidak memiliki peluang sama
sukses seperti wanita yang berada di bawah usia 35. Selain itu IVF memerlukan
biaya yang tinggi. Karena keberhasilan tidak dijamin, lebih dari satu embrio
sering ditransfer ke rahim untuk implantasi dengan harapan bahwa satu dari
embrio akan berhasil implan di dinding rahim dan mengembangkan(Trounson,
1992). Dalam beberapa kasus, lebih dari satu
embrio mungkin implan dan kehamilan jamak mungkin hadir. Juga, risiko kehamilan
ektopik (kehamilan terjadi di luar rahim) atau heterotrof kehamilan (kehamilan
kembar, yang satu didalam rahim dan yang lain di luar rahim). Resiko tersebut
lebih besar terjadi dibandingkan dengan kehamilan normal(Barenson, 1988).
BAB IV
PENUTUP
4.1
Kesimpulan
IVF
adalah suatu teknologi dengan carapembuahansecara manual menggabungkantelurdansperma di cawan petrilaboratorium. Faktor yang memepengaruhi
keberhasilan IVF antara lain usia. Semakin muda, maka angka keberhasilannyasemakinbesar.Faktor lain yang berpengaruh yaitu kualitas ovum dan sperma, durasi
infertilitas, kesehatan uterus, keahlian tim medis.
Keuntungan dari metode IVF yaitu peluang keberhasilan untuk hamil sangat besar
bagi pasangan yang infertil. Sedangkan kelemahan yang dialami yaitu,
membutuhkan biaya yang relatif tinggi.
4.2 Saran
Sebaiknya pada praktikum selanjutnya,
pelaksanaan dilakukan sesuai dengan prosedur yang telah tertulis pada modul
praktikum, sehingga dapatdiketahui uji apa saja yang dapat mempengaruhi
kualitas spermatozoa.
DAFTAR PUSTAKA
Barenson, M.L, D.M, Levine, and D. Rindskopf, 1988. Applied
Statistics A FirstCourse Prentice Hall. Ney Jersey.
Bavister, B.D, Rose-Hallakent and T. Pinyopumminter,
1992. Development ofMatured In Vitro Fertilized Bovine Embryo Into Morulae
and Blastocyts.Theriogenology, 37:127-146
Boediono. A., T. Suzuki, L. Y. Li and R. A. Godke. 1999. Off spring born
fromchimeras Reconstructed from parthenogenetic bovine embryos. J.Reprod.Fertil.
Dev. 7 : 1073 – 1079.
Cole,H.H and P.T. Cupps. 1997. Reproduction In
Domestic Animals. ThirdEdition. Academic press Inc London.
Gibbons, J.R, W.E. Beal, R.L. Krisher, E.G Faber, R.E.
Pearson, and F.C.Gwazdauskas, 1994. Effects of Once-Versus Twice Weekly
TransvaginalFollicularAspiration of Bovine Oocyte Recovery and
EmbryoDevelopment. Theorigenology 42:405-419.
Gordon, I. (1994). Laboratory Production of Cattle
Embryos. Department ofAnimal Science and Production. University College.
Dublin. Ireland.
Greve, T, V. Madison, B. Avery, H. Callsen, and P.
Hyteel, 1993. Production ofBovine Embryos, A Progess Report and Conseguences
on the GeneticUpgrading of Catlle Population. J. Anim. Reprod. Sci.
33:51-69.
Hyttel. P., I. Fair, H. Callsen and I. Greve. 1997. Oocyte
growth, capacitation andfinal maturation in cattle. J. Theriogenelogy. 47
: 23 – 32.
Lindsay, D.R, K.W. Entwistle, dan A. Winantea, 1982. Reproduksi
Ternak diIndonesia. Universitas Brawijaya. Fakultas Petrnakan. Malang.
Malole, M.B M., 1990 Kultur Sel dan Hewan.
Depdikbud Dirjen Dikti. PusatAntar Universitas Bioteknologi. IPB. Bogor.
Mogas, T.M.J., M.D Izquerdo dan Paramio. 1996. Development
Capacity of InVitro Maturated and Fertilized Oocytes from Prepubertal and
AdultGoats. Departement de Patologia de Produlecio. Animal
UniversityAutonoma de Barcelona. Spain.
Toelihere, M.R, 1985. Fisiologi Reproduksi pada Ternak.
Angkasa. Bandung
Trounson, A. 1992. The Production of Ruminant Embryos In
Vitro. Anim Reprod.Sci. 28:125-137.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar