PROFILE
LIMFOSIT T PADA MENCIT (Mus musculus) MODEL DIABETES
MELITUS
TIPE 2PASCA PEMBERIANMODIFIED CASSAVA FLOUR (MOCAF)
Oleh :
ERVIN JUMIATIN
0910913018
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012
BAB
I
PENDAHULUAN
1.1.Latar
Belakang
Diabetes
Mellitus digolongkan sebagai penyakit endokrin atau hormonal karena gambaran
produksi atau penggunaan insulin (Alwan,
1994).Dikenal dua
tipe diabetes mellitus, yaitu diabetes mellitus1 dan diabetes mellitus2.
diabetes mellitus2 merupakan
kumpulan gejala yang timbul oleh adanya peningkatan kadar glukosa darah akibat
kekurangan insulin baik absolut maupun relatif (Suyono, 2005). Penyakit
Diabetes Mellitus tipe 2, kebanyakan disebabkan oleh gaya hidup yang kurang
baik, salah satu penyebabnya karena pola makan yang kurang sehat. Penderita
Penanggulangan
Diabetes Mellitus tipe 2 meliputi dua pendekatan, yaitu pendekatan tanpa obat
(diet makanan rendah karbohidrat) dan pendekatan dengan obat. Pendekatan tanpa
obat dilakukan dengan cara pengaturan pola makanan dan latihan jasmani,
sedangkan pendekatan dengan obat dilakukan dengan terpai insulin. Dengan
kondisi ini, maka perlu adaptasi diet bagi pendertita Diabetes Mellitus tipe 2,
namun adaptasi ini tidaklah harus mengubah jenis pangan yang sudah ada seperti
mie, kue dan roti, namun dapat dilakukan hanya dengan mengubah bahan dasar
pembuatnya saja dengan menggunakan bahan dasar yang sedikit mengandung
karbohidrat yang mudah dimetabolisme oleh sel di dalam tubuh, seperti
penggunaan mocaf.
Menurut
Subagio(2007), Modified cassava flour (mocaf) merupakan singkong
yang diolah dengan teknik fermentasi dengan tujuan memecah dinding sel dari
singkong yang terdiri dari selulosa dan pektin. Akan
tetapi,
pada teknik fermentasi ini amilum (pati) tidak dihidrolisis untuk mendapatkan
pati murni. Menurut Nwokocha (2008). Pembuatan mocafmenggunakan bakteri indigenous
yang hanya mampu menghasilkan
enzim selulose dan pektinolase yang mampu menghidrolisis dinding sel singkong sehingga
pati dapat keluar dari dalam sel.
1.2.Perumusan Masalah
Dari
uraian
tersebut diatas, permasalahan
yang ingin dijawab pada penelitian ini adalah:
1.
Bagaimanapengaruh tepung mocaf terhadap perkembangan limfosit T?
2.
Bagaimanateknikmenganalisa
profile limfosit T pascapemberian tepung
mocaf pada mencit Diabetes
Mellitus tipe 2?
1.3.Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah:
a.
Untuk mengetahui pengaruh tepung mocaf terhadap
perkembangan limfosit T
b.
Untuk menganalisa profile limfosit T pasca pemberian tepung mocaf pada
penderita Diabetes Mellitus tipe 2
BAB II
TINJAUAN
PUSTAKA
1.1.
Ketela Pohon (Manihot
esculenta)
Ketela
Pohon (Manihot esculenta Crantz.)
merupakan tanaman pangan yang berasal dari benua Amerika berupa perdu, memiliki
nama lain ubi kayu, singkong, kasepe, dalam bahasa inggris cassava. Ketela
pohon termasuk famili Euphorbiaceae yang umbinya dimanfaatkan sebagai sumber
karbohidrat dan daunnya dikonsumsi sebagai sayuran Di Indonesia, ketela pohon
menjadi makanan bahan pangan pokok setelah beras dan jagung(Halim
danSiswanto, 1990).Singkong (ubi kayu) merupakan tanaman tipikal daerah tropis.
Iklim yang panas dan lembab dibutuhkan untuk pertumbuhannya sehingga tanaman
ini tidak dapat tumbuh pada suhu kurang dari 10°C. Suhu optimum pertumbuhan
sekitar 25-27°C dan tumbuh baik pada ketinggian kurang dari 150 meter di atas
permukaan laut, meskipun ada beberapa varietas yang dapat tumbuh pada ketinggian
1500 m atau lebih. Curah hujan yang diperlukan rata-rata 500-5000 mm per tahun.
Singkong dapat tumbuh pada tanah berpasir hingga tanah liat, maupun pada tanah
yang rendah kesuburannya (Grace, 1997).
Setelah singkongdipanen, jaringan sel pada umbi masih hidup dan terus
melakukan respirasidengan mengeluarkan CO2, H2O, dan
panas. Jumlah CO2 yang dikeluarkan olehumbi segar sekitar 2-4
mg/g/hari (basis kering). Selama penyimpanan respirasinya meningkat, jumlah CO2
yang dikeluarkan pada hari pertama sekitar 7.5 mg/g/haridan mencapai maksimum
9.7 mg/g/hari pada hari ketiga. Kecepatan respirasiterakhir tersebut
menyebabkan kehilangan bahan kering sebesar 0.7%. umbi singkong akan mengalami proses kerusakan
dalam waktu 48 jam, yang diawali dengan perubahan-perubahan enzimatik dalam
umbi, kemudian pembusukan(Halim danSiswanto, 1990).
Pati pada tanaman singkong berupa
polisakarida yang terbentuk dari tanaman hijau melalui proses fotosintesis.Pati
mengandung 10% air pada RH 54% dan 20oC.Menurut (2008), umumya pati
tersusun dari amylose dan amylopectin.Amylose merupakan polimer berbentuk panjang dan lurus dan sedikit
cabang (kurang dari 1%), Amilosa dengan rantai lurus lebih sulit dicerna
dibandingkan dengan amilopektin yang memiliki rantai bercabang, sehingga karbohidrat
dengan kandungan amilosa tinggi umumnya akan memiliki indeks glikemik rendah
dan sangat baik dikonsumsi bagi penderita diabetes. Unit-unit glukosa terhubung
oleh ikatan α-1,4 pada molekul amylose.
Molekul amylose berbentuk helix dan bersifat hidrofobik.
1.2.Modified Cassava Flour(mocaf)
Mocaf adalahtepung yang
dibuat dari ubi kayu melibatkan proses fermentasi pada tahap perendamannya. Modified
Cassava Flour (mocaf)
pada dsarnya berupa
produk turunan daritepung singkong dengan
menggunakan prinsip modifikasi sel singkong secarafermentasi (Subagio, 2007). Pada proses
perendaman, dihasilkan limbah cair, yaitu air hasil rendaman chip ubi kayu yang
difermentasi menggunakan bioaktivator, berupa campuran bakteri asam laktat, Lactobacillus sp, selubizing phospate bacteria, Azetobacter sp dan ragi. Keunggulan dari tepung
mocaf antara lain, tersedia
bahan baku yang cukup banyak di Indonesia untuk memproduksi tepung mocaf, harga tepung mocaf relatif lebih murah
dibandingkan dengan hargatepung terigu maupun tepung beras(Sari, 2011).
Tahapan pembuatan tepung mocaf terdiri dari dua jenis, yaitu tahap pertama yaitupembuatan chip, merupakan proses awal tepung yang
dibuat dari bahan dasar yang disebut dengan chip.Chipberupaketela pohon yang diiris
kecil, direndam dengan menggunakan inokulum bakteri yang dapat menghasilkan enzim selulose dan pektinolitik dan dijemur hingga kadar airnya mencapai 10%. Tahap kedua
yaitu, penepungan,
penggilingan chiphingga menjadi tepung mocaf (Sari, 2011).
Degradasi
secara biologis adalah pemecahan bahan organik yang melibatkan aktivitas
mikroorganisme.Kontaminan ini dapat digunakan oleh mikroorganisme sebagai
sumber makanan atau substrat.Setiap tahapan degradasi dikatalisis oleh enzim
spesifik, yang seringkali ditemukan di dalam sel ataupun yang dibuat dan
dilepaskan dari sel untuk membantu menginisiasi reaksi degradasi.Enzim yang
ditemukan di luar sel dikenal sebagai enzim ekstraseluler, penting dalam
degradasi makromolekul seperti polimer selulosa tanaman.mikroba yang
tumbuh padasingkong akan menghasilkan enzim pektinolitik dan selulolitik yang
dapat menghancurkan dinding sel singkong sedemikian rupa sehingga
terjadipembebasan granula pati. Proses pembebasan granula pati ini akan
menyebabkanperubahan karakteristik dari tepung yang dihasilkan berupa naiknya
viskositas,kemampuan gelasi, daya rehidrasi, dan kemudahan melarut. Selanjutnya
granulapati tersebut akan mengalami hidrolisis menghasilkan monosakarida
sebagai bahan baku untuk menghasilkan asam-asam organikMakromolekul akan
dipecah menjadi subunit yang lebih kecil di luar sel supaya molekul tersebut
dapat ditransfer ke dalam sel (Lutfiyah,
2008).
Berdasarkan kandungan karbohidrat pada beberapa komoditi pangan yang
dijadikan bahan dasar pembuatan tepung singkong memiliki kandungan sumber
karbohidrat yang sedikit. Hal
ini bisa dilihat pada tabel 2.1.1.dan 2.1.2.
Tabel 1.2.1 Kandungan karbohidrat
pada jagung, beras dan gandum per 100 gram (%)
|
Komoditas
|
Karbohidrat
|
Protein
|
Lemak
|
Serat
|
|
Foxtail millet
Pearl millet
Prosomillet
Jagung
Beras
Gandum*
|
84,2
78,9
84,4
80,0
87,7
68,03-75,90
|
10,7
12,8
12,3
10,5
8,8
10,3-15,4
|
3,3
5,6
1,7
4,9
2,1
1,54-2,47
|
1,4
1,7
0,9
2,7
0,8
2,29
|
(Sumber:
USU, 2011).
Beberapa kelebihan MOCAF adalah aman untuk para penderita diabetes, aman
untuk para penderita autis, tidak mengandung kolesterol, memilikimasa simpan
hingga 12 bulan, tekstur lebih lembut dibanding terigu, dan hargayang lebih
murah(Subagio, 2007).
Beberapa
mikroorganisme yang berasal dari Genus Trichoderma
dan Aspergillus telah diseleksi dan
dikembangkan dalam sebuah proses sakarifikasi secara enzimatik untuk berbagai
jenis bahan selulosa. Namun dapat pula menggunakan bakteri BAL untuk proses
fermentasi tepung. Ruminococcus dan Fibrobacter adalah bakteri
selulolitik yang paling umum ditemukan dalam rumen, selain itu dalam sebuah
studi molekular sejumlah spesies yang termasuk dalam Genus Clostridium telah ditemukan ada dalam rumen (Burrel et al., 2003).
1.3.Spleen
Spleen
(limfa) merupakan organ limfoid sekunder. Spleen terdiri dari bagian yang disebut
pulpa merah. Pada tempat ini terjadi penghancuran sel darah merah yang sudah
tua. Pulpa merah adalah tempat utama filtrasi spleen. Pulpa merah berselang-seling dengan pulpa putih. Pulpa putih atau spleenik white pulp adalah jaringan limfoid primer dan
lokasi utama aksi imun dan fagositik. Disini, spleen memproses antigen awal dan
menghasilkan imunoglobulin spesifik . Limfosit dan sel dendritik
yang membawa antigen datang bersama pada periarteriolar sheath.Pada setiap
pulpa putih, darah yang membawa limfosit dan antigen mengalir dari arteri
trabekula masuk ke arteri sentral.Sel dan antigen kemudian masuk ke dalam sinus
dan berlanjut menuju vena trabekula.Sinus marginal dikelilingi oleh zona
marginal limfosit. Di dalam sinus marginal dan di sekeliling arteri sentral
terdapat periarteriolar lymphoid sheath (PALS), yang tersusun oleh sel T. Sintesis antibodi pada pulpa putih dan
memindahkan dari darah dan sirkulasi lymph node, antibodi menyelimuti bakteri
sama seperti antibodi menyelimuti sel darah merah.
Meskipun susunan spleen dan lymph node mempunyai persamaan, namun antigen yang
masuk ke spleen lebih banyak berasal dari darah daripada dari cairan
ekstraselluler (lymph) (Brender et al, 2008).
1.4.Sel LimfositT
Limfosit merupakan sel yang mampu mengenal dan
menghancurkan berbagai determinan antigenik yang mempunyai dua sifat pada
respon imun khusus, yaitu spesifitas dan memori. Menurut June (2009), sel T
merupakan tipe limfosit yang berperan dalam proses infeksi dan perlawanan dalam
darah. Peran normalnya yaitu membunuh sel – sel yang terinfeksi virus dan
beberapa sel kanker. Secara umum, sel T terdiri dari:
- Helper T-cell (Sel T penolong) yang membantu fungsi dari sel B. Tipe sel imun ini menstimulasi sel T pembunuh, makrofag, dan sel B untuk membuat respons imun. Dinamakan pula sebagai CD4+ limfosit T.
- Suppressor T-cell (Sel T penekan) yang peranannya terbagi menjadi 2, yaitu menghambat sel B dan menghambat sel T.
- Cytotoxic T-Cell (Sel T sitotoksik) yang merupakan imunisasi pasif didapat dimana sel menyerang antigen secara langsung.
Peranan
dari
limfosit T atau sel T dimana sel T dibentuk
di sumsum tulang yaitu sebagai proliferasi dan diferensiasi yang terjadi di
kelenjar timus. Sel T berfungsi dalam pertahanan terhadap bakteri
(intraselular), virus, jamur, parasit, sel – sel ganas dan lain – lain.
Limfosit
T berbeda dengan limfosit B dalam hal respon terhadap antigen, akan menghasilan
antibodi spesifik. Limfosit T, dalam aktivitasnya harus melihat antigen di
permukaan makrofag atau Antigen
Presenting Cell (APC) bersama-sama dengan produk MHC. Ketika ada antigen
masuk ke dalam tubuh, makrofag akan memfagosit antigen tersebut dan dengan
bantuan enzim yang terdapat di dalam sitoplasmanya antigen akan didegradasi
menjadi molekul yang lebih kecil.molekul antigen kemudian bergabung dengan MHC
Class II dan ditransfer ke permukaannya sehingga akan dikenali oleh reseptor
sel Th CD4 (Roitt, 1989)
1.5.Streptozotocin(STZ)
Streptozotocin (STZ) merupakan
suatu jenis antibiotika yang mempunyai efek toksik, pertama kali diisolasi dari jamur Streptomyces achromogenes.Streptozotosin
merupakan derivat nitrosourea yang diisolasi dariStreptomyces achromogenes, mempunyai aktivitas anti-neoplasma
danantibiotik spektrum luas. Streptozotosin dapat secara langsung merusakmasa
kritis sel β Langerhans atau menimbulkan proses autoimun terhadapsel β (Rowland
dan Bellush; 1989; Rees dan Alcolado, 2005 dalam Nugroho,2006).Streptozotosin
(STZ) atau 2-deoksi-2-[3-(48yste-3-nitrosoureido)-Dglukopiranose]diperoleh dari
Streptomyces achromogenes dapat digunakanuntuk menginduksi baik DM tipe 1
maupun tipe 2 pada hewan uji. Streptozotocin termasuk dalam golongan nitrourea
yang artinya kelompok senyawa larut lemak yang memiliki fungsi sebagai agen
pengalkilasi. Injeksi streptozotocin secara intramuskular dan subcutan tidak
dianjurkan karena obat dianggap mengalami degradasi di dalam tubuh sebelum
mencapai target organ yaitu pankreas.
STZ sejak lama digunakan sebagai agen diabetogonik
pada hewan coba karena bersifat sitotoksik spesifik bagi sel beta pankreas.Streptozotocin
menginduksi diabetes pada berbagai spesies hewansehingga menyerupai adanya
hiperglikemik pada manusia.Efek ini telahsecara ekstensif tampak dengan adanya
penurunan sel beta nicotinamideadenine dinucleotide (NAD+) dan menghasilkan
perubahan histopathologypulau pankreas sel beta hepatomegaly berhubungan dengan
diabetesstreptozotocin-induced.Streptozotocin dapat
menggagalkan penggunaan glukosa disebabkan alkilasi terhadap protein yang
berperan dalam uptake dan metabolisme glukosa, streptozotocin ini mampu merusak
mitokondria dan menggagalkan proses oksidasi, serta mampu merusak DNA.
Faktor-faktor tersebut adalah terganggunya persediaan energi sehingga terjadi
kematian sel-sel beta pankreas. Streptozotocin secara
efektif dapat menginduksidiabetes pada kelinci yang ditandai dengan polydipsia,
polyuria, danhyperglycemia (Rowland dan Bellush; 1989; Rees
dan Alcolado, 2005 dalam Nugroho,2006).STZ menembus sel β Langerhans melalui tansporter glukosa GLUT 2.Aksi STZ
intraseluler menghasikan perubahan DNA sel β pankreas. AlkilasiDNA oleh STZ
melalui gugus nitrosourea mengakibatkan kerusakan pada selβ pankreas.Pemberian STZ menyebabkan penurunan pembentukan 8 senyawa ATP pada sel
beta pankreas yang akhirnya akan menyebabkan kematian sel beta pankreas (Wilson
dkk., 1998).
Streptozotocin dapat merusak DNA sel-sel pulau pankreas, dan menstimulasi
sintesis poli nuklear (ADP-ribosa), NAD, dan NADP yang kemudian akan menghambat
atau menghalangi sintesis proinsulin dan akhirnya menyebabkan diabetes.
Streptozotocin juga dapat mengaktifkan jenis-jenis oksigen seperti superoksida,
hydrogen peroksida, dan radikal hidroksil yang merupakan radikal bebas. Pemberian injeksi STZ
100 mg/kg
secara intraperitonial (ip) kepada seorang penderita DM 2, dapat menyebabkan hyperglycemia. Namun pemberian STZ pada dosis rendah, yaitu 40 mg/kg selama 5 hari mampu
menyebabkan
hiperglikemia yang signifikan pada minggu ke-1. Hewan-hewan mengalami diabetes
pada minggu ke-2 dan tetap dalam keadaan diabetes sampai minggu ke-5. Untuk
Diabetes Mellitus tipe 2 dengan injeksi 40 mg/kg BB dilarutkan dalam Buffer
sitrat (pH 4,5). Menurut Zhang (2008),
pemberian injeksi 2 kali dengan dosis 30 mg/ kg dengan interval mingguan akan
memberikan efek
Diabetes Mellitus tipe
2.Pada penelitian Arora (2009),injeksi dengan dosis 40 mg/kg menunjukkan hasil
terinduksinya mencit Diabetes
Mellitustipe
2,
tetapi akan mengalami tipe 1 untuk beberapa minggu.Streptozotocin pada hewan coba dapat menginduksi perkembangan
hiperglikemia yang lambat, kemudian diikuti dengan penyusupan lymphocytic pulau
pankreas lalu menyebar ke seluruh duktus pankreas. Selanjutnya limfosit akan
menghancurkan sel beta dalam islet pankreas dan akhirnya meyempurnakan
terjadinya diabetes mellitus (Wilson dkk.,
1998).
1.6.Diabetes
Mellitus Tipe 2
Diabetes
Mellitus tipe 2 merupakan penyakit metabolisme serius dan memiliki tingkat
prevalensi yang tinggi. Sembilan puluh persen
kasus DM yang ditemui di masyarakat adalah Diabetes Mellitus tipe 2
(Syamsudin dkk.,
2008). Diabetes Mellitus tipe 2 disebabkan karena resisten insulin hal ini terjadi akibat perubahan reseptor insulin
pada membran sel berkurang dan strukturnya berubah sehingga tidak tanggap
terhadap insulin. Kondisi ini menyebabkan glukosa yang masuk ke dalam sel
berkurang. Diabetes melitus tipe 2 dikenal sebagai NIDDM (Non-Insulin Dependent Diabetes Melitus), artinya penderita DM tipe
2 tidak mutlak membutuhkan suntikan insulin setiap hari untuk mengatur
metabolisme gula dalam darah. Diabetes tipe 2 merupakan akibat lemahnya
kemampuan pankreas mensekresikan insulin, selain itu juga lemahnya aksi
insulin, menjadi penyebab menurunnya sensitivitas insulin(Scobie,
2007).
Penurunan
sensitivitas insulin terjadi pada pintu masuk di permukaan sel tubuh yang
dinamakan reseptor insulin.Penyebab terjadinya penurunan sensitivitas insulin
adalah karena peningkatan kebutuhan sekresi insulin untuk mempertahankan kadar
glukosa darah. Reseptor
insulin akan memberikan signal pada transporter glukosa untuk memungkinkan
lewatnya glukosa yang dibawa oleh hormon insulin masuk ke dalam sel(Syamsudin
dkk.,
2008). Di dalam mitokondria, gula kemudian akan digunakan untuk menghasilkan
energi yang diperlukan untuk melangsungkan fungsi setiap sel tubuh.Patofisiologi
DM tipe 2 disebabkan oleh resistensi insulin perifer, rendahnya produksi
glukosa hepatik dan menurunnya fungsi sel betayang mengakibatkan kegagalan
fungsi sel beta.Prevalensi awal DM tipe 2 diawali oleh defisit sekresi insulin
dan pada sebagian besar penderita, defisiensi insulin berhubungan dengan
resistensi insulin perifer(Stumvoll et al.,
2005).
Penyakit ini ditandai dengan kelainandalam sekresei insulin maupun kerja
insulin. Pankreas masih relatifcukup menghasilkan insulin tetapi insulin yang
ada bekerja kurangsempurna karena adanya resistensi insulin (adanya efek
responjaringan terhadap insulin) yang melibatkan reseptor insulin dimembran sel
yang mengakibatkan penurunan sensifitas sel target,kehilangan reseptor insulin
pada membran sel targetnyamengakibatkan terjadi penurunan efektifitas serapan
glukosa daridarah, individu yang mengalami overwight memiliki potensial
yanglebih besar menderita diabetes di banding individu normal(Syamsudin dkk., 2008).
Kriteria kadar glukosa diabetesdengan pengukukuran glukosa darah sewaktu
>200 mg/dl, glukosa darahpuasa ≥ 126 mg/dl, dan kadar glukosa darah dua jam setelah
dilakukan testoleransi glukosa dengan beban glukosa 75 gram adalah ≥200 mg/dl (Scobie,2007).Kadar
gula darah yang normal cenderung meningkat secara bertahap, tetapi progresif
setelah usia 50 tahun, terutama pada orang yang tidak aktif bergerak. Seseorang
dikategorikan sebagai penderita Diabetes Mellitus, jika kadar gula darah ketika
puasa lebih dari 126 mg/dL dan kadar gula sewaktu lebih dari 200 mg/dL.
Kelebihan kadar gula dalam darah mengakibatkan munculnya tanda-tanda penyakit
Diabetes Mellitus. Beberapa gejala awal penderita DM antara lain cepat lelah,
kehilangan tenaga, lemas, sering buang air kecil, terus-menerus lapar dan haus,
kelelahan yang berkelanjutan, mudah sakit berkepanjangan, penglihatan kabur dan
luka yang sukar sembuh(Stumvoll et al.,
2005).
1.7.Insulin
Insulin merupakansalah satu hormon dalam tubuh manusia yang dihasilkan oleh
sel ß pulau langerhans yang terdapat dalam kelenjar pankreas. Hormon ini
menurunkan kadar glukosa, asam lemak, dan asam amino dalam darah.
Insulinterdiri atas dua rantai asam amino yang dihubungkan oleh ikatan
disulfidedisintesis sebagai protein perkusor (pro insulin) yang mengalami
pemisahanproteolitik untuk membentuk insulin dan peptide c, keduanya di
sekresikanoleh sel β pankreas (Mycek, 2001). Insulin mempunyai pengaruh luas di
dalam tubuh dan beraksilangsung atau tak langsung mempengaruhi proses
biokimiawi. Pengaruhmenyeluruh hormon ini adalah memudahkan pemakaian glukosa
oleh sel danmencegah pemecahan secara berlebihan glikogen yang disimpan di
dalamhati dan otot (Turner, 2000).Sekresi insulin diatur tidak hanya oleh kadar
glukosa darah tetapi jugaoleh hormon lain dan mediator autonomik. Sekresi
insulin dipacu olehglukosa darah yang tinggi dan difosforilasi dalam sel β
pankreas. Kadaradenosin trifosfat (ATP) meningkatkan dan menghambat saluran
K+,menyebabkan membran sel depolarisasi dan influx Ca++ yang menyebabkanpulsasi
eksositosis insulin (Mycek, 2001).
Peranan insulin dalam pengaturan kadar glukosa darah tidak lepas dari
pengaruh faktor lainnya juga, seperti (a) hati berperan sebagai glukostat, (b)
kelenjar pankreas sebagai penghasil hormon lain selain insulin yaitu glukagon,
(c) kelenjar adenohipofisis mensekresi hormon-hormon yang bersifat diabetogenik
seperti ACTH, GH, TSH; (d) kelenjar adrenal yang mensekresi hormon epinefrin
dari bagian medula dan glukokortikoid dari bagian kortek-nya, (e) kelenjar
tiroid mensekresi hormon T3 dan T4 yang berperan terhadap metabolisme energi,
serta(f) kerja fisik atau exercise yang bersifat memperkuat efek insulin terhadap
metabolisme karbohidrat (Goodman dan Gilman, 2007).
Faktor yang berperan dalam pengaturan sekresi insulin ialah, bermacam
nutrient, hormon saluran cerna, hormon pankreas dan neurotransmiter otonom,
glukosa, asam amino, asam lemak, dan benda keton merangsang sekresi insulin..
Sel-sel pulau langerhans dipersarafi oleh saraf adrenergenik dan kolinogernik.
Stimulasi reseptor α2 adrenergikmenghambat sekresi insulin, sedang β2
adrenergik agonis dan stimulasi sarafvagal akan merangsang sekresi insulin
(Goodman dan Gilman, 2007). Sekresiinsulin oleh sel beta tergantung oleh 3
faktor utama yaitu, kadar glukosa darah,ATP-sensitive K channels dan
Voltage-sensitive Calcium Channels sel beta. Sekresi insulin oleh sel beta
pankreas bergantung pada 3 faktor yaitu kadar glukosa darah, ATP-sensitive K channels dan voltage-sensitive calcium channels sel
beta pankreas (Mycek, 2001).
BAB III
METODOLOGI
3.1.
Waktu
dan Lokasi Penelitian
Penelitian
ini akan dilaksanakan mulai Juni 2012
sampai Januari 2013. Penelitian dilakukan di Laboratorium Fisiologi Hewan,
Jurusan Biologi,
Universitas Brawijaya, Malang.
3.2. Alat
dan Bahan Penelitian
Alat-alat
yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: erlenmeyer, cawan petri, jarum
ose, jarum enten, timbangan digital, mikropipet, blue tip dan yellow
tip, aluminium foil, gelas ukur, spatula, corong, termometer, stirrer, beaker glass, tabung reaksi, autoclave, inkubator, rotaryshaker,
pH meter, Laminar Air Flow (LAF), oven, mikroskop binokuler, mikroskop
BX51, Haemocytometer, handtally counter, colony counter danvortex.
Bahan-bahan
yang diperlukan antara lain ketela pohon (Manihot
esculenta) yang
berasal dari Kabupaten Malang. Carboxymethyl Cellulose (CMC) agar, pektin agar,
cat Gram, alkohol 70%, NaCl 0.85 %,
akuades dan bahan-bahan lainya untuk analisa.
3.3 Sampel penelitian
Jenis peneltian iniadalah penelitian
ekperimental. Berdasarkan ketentuan WHO jumlah sampel 3 ekor per kelompok.
Sehingga jumlah total sampel sebanyak 9 ekor. Sampel penelitian diambil secara
acak dari populasi terjangkau dengan kriteria inklusi antara lain mencit strain
BLB/c betina, umur 6-8 minggu dengan berat rata-rata 30 g dibagi menjadi 3
kelompok yaitu:
a.
Kontrol (K): diinjeksi dengan pelarut STZ 1.2 g tanpa perlakuan.
b.
Perlakuan 1: kelompok mencit normal yang telah diinduksi
STZ 1.2 g, diberi makan 50 g tepung mocaf setiap hari selama 3 minggu.
c.
Perlakuan2: kelompok
mencit normal yang telah diinduksi STZ 1.2 g,
diberi makan 50 g tepung gandum setiap hari selama 3 minggu.
3.4. Cara Kerja
3.1.1. Induksi STZ untuk Diabetes
Mellitus Tipe 2
Mencit dipuasakan
selama 12 jam sebelum
induksi Diabetes Melitus menggunakan STZ dengan dosis 40 mg/kg BB.Diaklimatisasi
selama 2 minggu. Diberi makan pelet BR 1 5-10 g/hari dan minuman secara teratur. STZ
dilarutkan dalam 0.01M buffer sitrat, pH 4,5 dan selalu disiapkan dalam kondisi
fresh untuk penggunaan dalam waktu 10-15 menit.
Injeksi STZ diberikan secara intraperitoneal dan dosis ditentukan berdasarkan
berat badan mencit. Injeksi STZ dilakukan selama 5 hari untuk menginduksi
diabetes
mellitus tipe 2.Rumus yang digunakan untuk menentukan kadar injeksi
STZ, yaitu dapat dilihat pada contoh perhitungan berikut
Diketahui :
Dosis
STZ 40 mg/kg BB, Berat Badan hewan uji = 30 gram, Stok yang dibuat =20 mg/ml,
volume lambung tikus max 200 µl
Jawab :
Volume
injeksi = 0.04 mg/gram BB x 30 gram
/ 20 mg/ml = 0.06 ml atau 60 µl
3.1.2. Perlakuan
Tikus Diabetes Mellitus Tipe 2 dengan STZ
Metode yang digunakan menurut Masruro (2010), mencit
Betina (Mus musculus) galur BALB/c,
umur 6-8 minggu
dengan berat rata-rata 30 g dibagi menjadi 6 kelompok yaitu: (1) kelompok tikus
sebagai kontrol negatif (diinjeksi dengan pelarut STZ tanpa treatment), (2)
kelompok tikus sebagai kontrol positif yang diinjeksi dengan STZ tanpa
treatment, (3) kelompok tikus normal yang telah diinduksi STZ 1.2 gram, diberi
makan 50 gram tepung mocaf setiap hari selama 3 minggu, (4) kelompok tikus normal
normal yang telah diinduksi STZ 1.2 gram, diberi makan 50 gram jagung rebus
setiap hari selama 3 minggu, (5) kelompok
5 yaitu tikus normal yang telah diinduksi STZ 1.2 gram, normal diberi makan 50
gram tepung gandum setiap hari selama 3 minggu, (6) tikus normal yang telah
diinduksi STZ 1.2 gram, diberi makan 50 gram tepung gandum setiap hari selama 3
minggu.
3.1.3. Pembuatan Tepung Mocaf dari Ketela Pohon (Manihot esculenta) dengan Bakteri Selulolitik dan Pektinolitik.
Pembuatan tepung MOCAF dilakukan
dengan cara yaitu, diambil sebanyak 7.5 kg ketela pohon (Manihot esculenta),
pertama dikupas, kemudian dicuci bersih dengan air mengalir. Ketela pohon yang
sudah bersih dipotong kecil-kecil ±2-3 cm. Ketela pohon yang sudah dipotong,
direndam dalam larutan bioaktivator yang mengandung bakteri selulolitik dan
bakteri pektinolitik dengan jumlah stok inokulum 2.107 cfu/mL, waktu proses
fermentasi ±8 jam. Setelah selesai proses fermentasi, ketela pohon yang telah
difermentasi dikeluarkan untuk dilanjutkan pada tahap kedua yaitu, ditiriskan
dengan air mengalir dan dikeringkan hingga mencapai kadar air 12-14%.
Selanjutnya dilakukan tahapan terakhir, yaitu digiling hingga menjadi tepung.
3.1.4. Perhitungan jumlah sel limfosit T CD4+ dan CD8+ dengan
Haemocytometer pada spleen
Sel hasil dari isolasi organ spleendiambil sebanyak 5µl
untuk penghitungan sel menggunakan haemocytometer yang dipasang pada mikroskop.
Suspensi pelet ditambahkan 95 µl
efans blue dan
dihomogenkan. Penghitungan
sel hidup menggunakan kamar hitung dalam haemocytometer dan hasil penghitungan
digunakan dalam analisa flowcytometry. Dihitung jumlah selnya menggunakan rumus, jumlah sel
yang hidup dalam 5 kotak dikalikan faktor pengencer dibagi dengan 5x4x10-6.
3.1.5. Analisis
ekspresi sel limfosit T CD4+ dan CD8+ dengan Flowcytometry
Homogenat 50 µl dimasukkan ke
dalam 4 microtube steril yang telah
berisi 1 ml PBS(Satwika, 2011).
Suspensi selanjutnya disentrifugasi pada 3500
rpm, 150C
selama 2 menit. Supernatan
dibuang dan pelet
diinkubasi dengan menggunakan
dua macam marker antibodi,
yang pertama antibody marker surface cell Β-Pankreas dan
ke dua adalah antibody marker intersel staining yang digunakan untuk
menunjukan sel yang menghasilakn insulin. Antibodi CD80, CD142, CD200 atau CD318
(Betacell, 2012), antimouse CD25 FITC
conjugated, PE-conjugated mouse anti-CD24 (clone ML5,BD Bioscience)(Jiang et al., 2011), serta CI2-FITC
(Kavishwar, et al.,2011) ke-6 antibodi yang digunakan
bertujuan untuk marker surface cell Β-Pankreas.
ab84987Anti-PDX1 antibody digunakan untuk intersel staining (Stefan et al.,2011). inkubasi dilakukan selama
15 menit. Pelet diambil dan dimasukkan dalam kuvet flowcytometer dan ditambah 500 µl PBS steril.Kuvet dipasang pada
nozzle BD FACS CaliburTM flowcytometer.Dilakukan setting pada komputer dengan software BD Cell Quest ProTM dan
dilakukan koneksi dengan flowcytometer
(acquiring mode). Parameter yang
diamati dalam penelitian ini meliputi parameter
kuantitatif (jumlah regenerasi sel β-Pankreas). Parameter kuantitatif
meliputi perubahan jumlah sel B pankreas pada mencit normal, kontrol positif
dan negatif serta mencit model Diabetes Mellitus tipe 2 yang telah di berikan
perlakuan yang diukur melalui flowcytometry.
DAFTAR PUSTAKA
Alwan, A, A, S.1994.Management of Diabetes Mellitus
Standards of
Care and Clinical
Practice Guidelines.Who-Em/Din6/E/G.
Bevelander, G & J.A.
Ramaley.1988.Dasar-Dasar HistologiEdisi
Kedelapan.Erlangga: Jakarta.
Brender. F.,
Burke, A., Richar, M. D., 2005. Limpa patient page. Journal of the american
medical association. 20 : 266-270.
Burrell,P. C.,et al.
2003. Identification,
detection and spatial resolution of clostridium populations responsible for
cellulose degradation in a methanogenic landfill leachate bioreactor. Appl. Environ. Microbiology.
70(4): 2414–2419.
Grace B.1997.
Peranan Ubi Kayu dan Permasalahannya di Indonesia. di dalamJ.Wargiono,
Saraswati, J. Pasaribu, dan Sutoro (eds.), Pengkajian danPengembangan Teknologi
Pra dan Pasca Panen Ubikayu I. Prosiding.Lampung : Seminar Nasional UPT-EPG
BPPT.
Grahito, A. 2007.Root and Tuber Crops.http://indonesian-foodforage. Diakses tanggal 06
Maret 2012.
Jiang, W., et al. 2011. CD24: A novel surface marker for pdx1-positive
pancreatic progenitors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells ;29:609–617.
Kavishwar, A., Zdravka, M.&Anna, M. 2011. Unique
sphingomyelin patches are targets of a beta cell specific antibody. Molecular
Imaging Laboratory, MGH/MIT/HMS Athinoula A. Martinos Center for Biomedical
Imaging, Department of Radiology.Massachusetts
General Hospital.Harvard
Medical School.
Boston. Massachusetts
02129.
USA.
Lutfiyah, A. 2008.Potensi Bakteri
Selulolitik dari
Usus Rayap dalam
Dekomposisi Serasah Agroforestri Budidaya Porang (Amorphophallus Oncophyllus). Jurusan Biologi.Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam.
UniversitasBrawijaya.
Malang. Skripsi.
Masruro, N.2010. Aktivasi Protein
Insulin Reseptor Substrat I (IRS-I) oleh Glukomanan dari Tepung Porang untuk
Meminimalisir Kerusakan Sel Beta Pankreas Tikus Diabet. Jurusan Biologi.
Fakultas MIPA. Brawijaya. Malang. Skripsi.
Mycek, Mary
J. 2001. Farmakologi: Ulasan bergambar Ed.2. Jakarta: WidyaMedika.
National Diabetes Fact Sheet.
2007.Treatment with
Insulin or
Oral Medication Among Adults with
Diagnosed Diabetes. United States, 2004-2006. http://www.cdc.gov/
diabetes/pubs/pdf/ndfs_2007.pdf. Diakses
tanggal 14
April 2012.
Nugroho,
Agung Endro. 2006. Review Hewan Percobaan Diabetes Mellitus:Patologi Dan
Mekanisme Aksi Diabetogenik. Fakultas FarmasiUniversitas Gadjah Mada.
Nurdiana., N., dkk. 1998. Efek streptozotocin
sebagai bahan diabetogenik pada tikus wistar dengan cara intraperitonial dan
intravena. Majalah Kedokteran Unibraw.
Vol. XIV. No2:hal.66-77.
Sari, P. R. 2011.Analisa Nilai
Tambah dan Kelayakan Usaha Agroindustri Chip
UbiKayu sebagai Bahan Baku Pembuatan MOCAF (Modified
Cassava Flour) di Kabupaten Trenggalek.Jurusan Sosial Ekonomi Pertanian.
Fakultas Pertanian. Universitas Brawijaya. Malang. Skripsi.
Satwika, D. 2011.Fraksi Air Bunga
Kecubung (Datura metel L.) Memicu Aktivitas
Imunokompeten Subset Sel T pada
Mencit Balb/C Model Asma. Jurusan Biologi. Fakultas MIPA. Brawijaya. Malang.
Skripsi.
Shofie, M. 2007. Asosiasi antara Trichoderma Viride dan Gliocladium Sp. serta Aplikasinya dalam
Kompos untuk Mengendalikan Penyakit Layu Fusarium pada Tanaman Pisang Cavendis. Jurusan Biologi. Fakultas
MIPA. Brawijaya. Malang. Skripsi.
Stumvoll,M., Goldstein B. J. & Van Haeften, T. W. 2005. Type 2
diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet. 365: 1333-46.
Subagio, A. 2007.Industrialisasi Modified Cassava Flour (MOCAF) sebagai
Bahan Baku Industri Pangan untuk Menunjang Diversifikasi Pangan Pokok
Nasional.Fakultas Teknologi Pertanian.Universitas
Jember. Jember.
Sudarmadji, S., Haryono, B.,
Suhardi.1997. Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan dan Pertanian. Edisi
Keempat. Penerbit Liberty. Yogyakarta.
Suyono, S. 2005. Patofisiologi
Diabetes Mellitus
dalam Penatalaksanaan Diabetes Mellitus
Terpadu:
Pusat Diabetes dan Lipid RSUP Nasional Dr. Cipto Mangunkusumo. Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia.Jakarta.
Syamsudin, Rita, D. Marletta& Kusmardi. 2008.
Immunomodulatory and in vivo antiplasmodial activities of propolis extract. Global Journal of Pharmacology.Vol. 2,
no.3. pp. 37-40.
Tuner,
Donnel C dan Bagnara Joseph T. 1988. Endokrinologi Umum. Alihbahasa
Drs.Harjoso. Yogyakarta: Airlangga press
USU. 2011. Karbohidrat Gandum.
repository.usu.ac.id/bitstream/.../Chapter%20II.pdf. Diakses pada tanggal 02
Maret 2012
Wilson G. L., et al. 1988. Mechanism of nitroroure induced beta cell
damage. activation of poly (adp-ribose) syntase and cellular distribution. Diabetes:37:213-216.
Zhang, M.,et al. 2008. The characterization of high-fat diet and multiple
low-dose streptozotocin induced type 2 diabetes rat model. Exp Diabetes Res. 2008; 2008: 704045. PMCID: PMC2613511.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar